PLoS ONE: NPRL2 sensibiliserer Humant Ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) Celler til cisplatin behandling ved Regulering Key Komponenter i DNA Repair Pathway

abstrakt

NPRL2, en af ​​tumorsuppressorgener bopæl i en 120 kb homozygote deletion region af humant kromosom band 3p21.3, har en høj grad af aminosyresekvenshomologi med nitrogenatomet permease regulator 2 (Npr2) gærgen, og mutationer af

NPRL2

i gærceller er forbundet med resistens over for cisplatin-medieret celledrab. Tidligere viste vi, at genoprettelsen af ​​NPRL2 i NPRL2-negative og cisplatin-resistente celler resensitize lunge kræftceller til cisplatin behandling

in vitro og in vivo

. I denne undersøgelse, viser vi, at sensibilisering af ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) celler til cisplatin ved NPRL2 opnås gennem regulering af nøglekomponenter i DNA-skader checkpoint pathway. NPRL2 kan phosphorylere ataksi telangiectasia muteret (ATM) kinase aktiveres af cisplatin og fremme nedstrøms γ-H2AX dannelse

in vitro

in vivo

, som opstår under apoptose i takt med den oprindelige udseende af høj- molekylvægt DNA-fragmenter. Desuden denne kombination behandling resulterer i højere Chk1 og Chk2 kinase aktivitet end gør behandling med cisplatin alene og kan aktivere Chk2 i pleural metastaser tumor xenograft i mus. Aktiveret Chk1 og Chk2 øge ekspressionen af ​​cellecyklus checkpoint proteiner, herunder Cdc25A og Cdc25C, hvilket fører til højere niveauer af G2 /M standsning i tumorceller behandlet med NPRL2 og cisplatin end i tumorceller behandlet med kun cisplatin. Vore resultater antyder derfor, at ektopisk ekspression af NPRL2 aktiverer DNA beskadigelse checkpoint pathway i cisplatin-resistente og NPRL2-negative celler; derfor kan kombinationen af ​​NPRL2 og cisplatin resensitize cisplatin nonresponders til cisplatin behandling gennem aktivering af DNA beskadigelse checkpoint pathway, hvilket fører til celle standsning i G2 /M-fasen og induktion af apoptose. Den direkte konsekvens af denne undersøgelse er, at kombinationsbehandling med NPRL2 og cisplatin kan overvinde cisplatin modstand og forbedre terapeutisk effekt

Henvisning:. Jayachandran G, Ueda K, Wang B, Roth JA, Ji L (2010)

NPRL2

sensibiliserer human ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) Celler til Cisplatin Behandling ved Regulering centrale elementer i DNA Repair Pathway. PLoS ONE 5 (8): e11994. doi: 10,1371 /journal.pone.0011994

Redaktør: Kerstin Borgmann, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, Tyskland

Modtaget: December 7, 2009; Accepteret: 9 juli 2010; Udgivet: August 5, 2010

Copyright: © 2010 Jayachandran et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev delvist støttet af tilskud fra National Cancer Institute, National Institutes of Health, SPORE P50CA70907, R01CA116322, og MMHCC U01CA10535201; tilskud fra det amerikanske forsvarsministerium Lung Cancer Program PROSPECT (DAMD17-02-1-0706); The University of Texas M. D. Anderson Cancer Center Support Core Grant (CA-16672); og et tilskud fra Tobak Settlement fondene tilegnet af Texas State lovgivende. De finansieringsorganer havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

NPRL2 /Gene 21

(GenBank accession # AF040707), som er 1351 bp lang og koder for et protein på 380 aminosyrerester, er en af ​​de tumorsuppressorgener identificeret i en 120 -kb homozygot deletion region på humant kromosom band 3p21.3 [1], [2]. Den hyppige og tidlig tab af heterozygositet og de overlappende homozygote deletioner observeret i 3p21.3 region i lunge og brystcancer tyder på en kritisk rolle af en eller flere 3p21.3 gener i den molekylære patogenese af disse cancere [1], [3] .

kvælstof permease regulator 2 (Npr2) gær genet (GenBank # P39923) blev identificeret som en ny komponent involveret i celle drab udløst af cisplatin. Fordi afbrydelse af Npr2 blev vist at bibringe resistens over for cisplatin, blev det antaget, at NPRL2 kan anvende en tilsvarende mekanisme til at mediere cytotoksicitet lægemidler mod cancer [4]. Vi har for nylig fundet, at reexpression af NPRL2 i NPRL2-negative og cisplatin-resistente celler betydeligt resensitized respons af disse celler til cisplatin behandling, som det fremgår af reduceret cellelevedygtighed og øget apoptose

in vitro

i vivo

[5]. Men de molekylære begivenheder, der er ansvarlige for resensitization til cisplatin af

NPRL2

er ikke blevet identificeret. I denne undersøgelse har vi forsøger at forstå den molekylære forbindelse mellem NPRL2 og cisplatin overvinde medikamentresistens.

Virkningerne af cisplatin medieres via høje niveauer af DNA-skader, hvilket fører til programmeret celledød eller cellecyklusstandsning [6 ]. De dobbeltstrengede DNA-brud induceret af cisplatin medieres gennem en central DNA-skader-signalvej styres af ataksi telangiectasia muteret (ATM) kinase samt adskillige andre DNA-beskadigelse-responsive kinaser [7], [8]. Phosphorylering af ATM på serin-1981 har vist sig at phosphorylere histon H2AX [9], og phosphorylering af histon H2AX ved serin-139 (γ-H2AX) er afgørende for rekruttering af mediatorer såsom MDC1 (mediator af DNA beskadigelse checkpoint protein 1), 53BP1 (p53-bindende protein 1), BRCA1 (brystkræft 1), og MRE11 (meiotisk rekombination 11) -RAD50 (strålingssensitive 50) -NBS1 (Nijmegen brud syndrom 1) -kompleks [10] – [13]. Phospho-ATM letter phosphorylering af disse mæglere, og dannelsen af ​​nukleare foci af de aktiverede molekyler fremmer overførsel af DNA-skader signal til downstream mål, såsom Chk1 (tjek punkt kinase 1), Chk2 (check point kinase 2), og SMC1 (strukturel vedligeholdelse af kromosom 1) [14] – [16]. Chk1 og Chk2 er involveret i forskellige DNA-skade respons, herunder celle-cyklus checkpoint, genom vedligeholdelse, DNA-reparation, og apoptose [17].

Derfor har vi en hypotese, at sensibilisering af ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) celler til cisplatin efter NPRL2 kan skyldes den direkte regulering af nøglekomponenter i DNA-skade checkpoint pathway. For at teste denne hypotese analyserede vi virkningerne af den ektopiske ekspression af NPRL2 i nærvær eller fravær af DNA-ødelæggende middel cisplatin på tumorcellevækst og apoptose i et panel af NSCLC-cellelinier med varieret status af det endogene NPRL2 genet og proteinekspression og cisplatin følsomhed. Vi viser, at reexpression af NPRL2 i NPRL2-negative og cisplatin-resistente celler betydeligt aktiverer de centrale komponenter, herunder ATM, Chk, og H2AX og resensitizes lungekræft celler til cisplatin behandling

in vitro

i vivo

, hvilket fører til standsning af cellecyklus i G2 /M-fasen og induktion af apoptose. Resultaterne af denne undersøgelse også låne eksperimentel support til vores hypotese, at NPRL2 fungerer muligvis ikke kun som en prognostisk biomarkør for følsomhed over for cisplatin, men også som et terapeutisk middel til resensitizing nonresponding kræftceller til cisplatin.

Materialer og Metoder

cellelinjer og cellekultur

De humane NSCLC cellelinjer H1299 [5] og H322 [5], med forskellige 3p21.3 status beskrevet tidligere [18], [19], var bruges til

in vitro

og

in vivo

eksperimenter. H1299 og H322 er cisplatin-resistente (50% hæmmende koncentration [IC

50] og IC

20 værdier for cisplatin i H1299 var 7,6 og 3,0 uM henholdsvis og i H322 var 13,1 og 5,0 uM som henholdsvis vurderet ved XTT-assay) og ikke udtrykker NPRL2 protein (som vurderet ved Western blotting) [5]. Den cisplatin-sensitive NSCLC cellelinje H1437 og cisplatin-resistente cellelinje H1437R er blevet beskrevet tidligere [5].

Antistoffer, reagenser, og dosering

Anti-ATM (5C2), anti- Chk1 (G-4), anti-Chk2 (H-300), anti-Cdc25A (F-6), anti-cyclin B1 (GNS1), og anti-caspase-2 (H-19) blev indkøbt fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Anti-phospho-Chk1 (Ser345), anti-phospho-Chk2 (Thr68), anti-phospho-Chk1 (Ser345), anti-NBS1, anti-phospho-NBS1 (Ser343), anti-SMC1, anti-phospho-Cdc25C ( Ser216), anti-phospho-Cdc2 (Tyr15), anti-caspase-3 og anti-caspase-9 blev indkøbt fra Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Anti-ATM Protein kinase pS1981 var fra Rockland Immunochemicals (Gilbertsville, PA), anti-phospho-histon H2AX (Ser139) var fra Upstate Biotechnology (Lake Placid, NY), anti-phospho-SMC1 var fra Novus Biologicals (Littleton, CO) og anti-caspase-8 og anti-poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) var fra BD Biosciences Pharmingen (San Diego, CA).

i alle Western blotting, anti-β-actin (Sigma , St. Louis, MO) blev anvendt som indlæsning kontrol. Cisplatin blev indkøbt fra Bristol-Myers Squibb Company (Princeton, NJ). DOTAP blev anvendt til at transficere plasmidvektorer til H1299 og H322 celler. Cisplatin-behandling blev altid administreret til celler på IC

20 dosering (5). DOTAP: cholesterol (DOTAP: Chol). (20 mM) i 5% dextrose i vand, der anvendes til

in vivo

eksperimenter blev syntetiseret ved vores laboratorium med anvendelse af tidligere beskrevne standardprocedurer [5]

Konstruktion af plasmidvektorer udtrykkende NPRL2

NPRL2 cDNA blev udskåret fra plasmidet pAd-RAP-NPRL2 [2] indeholdende human NPRL2 cDNA og ligeredes i multikloningsstedet af pdCpG-KGB2 ekspressionsvektor. Kloningsstrategien er tidligere blevet beskrevet [5]. Tom vektor (pdCpG-KGB2) og en plasmidvektor, der udtrykker LacZ-genet blev anvendt som negative kontroller. Vi havde tidligere bekræftet, at transfektion af denne NPRL2 vektor faktisk kunne udtrykke eksogene NPRL2 protein

in vitro

in vivo

[5] ved hjælp af anti-NPRL2 antistof købt hos Abcam (Cambridge, MA ).

Immunfluorescensfarvning og flowcytometrisk analyser for γ-H2AX

Immunfluorescensfarvning blev udført i celler dyrket i kammer dias. På angivne tidspunkter blev H1299-celler behandlet med NPRL2 med eller uden cisplatin fikseret i 10% formalin og inkuberet med anti-phospho-histon H2AX (Ser139) (1:100) antistoffer i 5% phosphatbufret saltvand (PBS) med bovint serumalbumin i 1 time ved stuetemperatur. Efterfølgende blev cellerne inkuberet med æsel-anti-muse-IgG-fluoresceinisothiocyanat (FITC) (Santa Cruz Biotechnology) fortyndet 1:100 i PBS i 45 minutter, og prøverne blev monteret med Vectashield mounting medium med 4 ‘, 6-diamidino- 2-phenylindol (DAPI) (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA) for at modfarve kernerne. Straks blev objektglassene undersøgt med anvendelse af et fluorescensmikroskop. Også efter inkubation af FITC-antistof, blev cellerne høstet, og FITC-positive celler blev talt ved flowcytometrisk analyse.

Chk1 og Chk2 kinaseaktivitet assay

Chk1 og Chk2 kinaseaktivitet i H1299-celler behandlet med NPRL2 med eller uden en IC

20 værdien af ​​cisplatin blev vurderet med anvendelse af en K-LISA Checkpoint Activity Kit (EMD Biosciences, San Diego, CA), som er et enzym-bundet immunsorbentassay (ELISA) -baseret aktivitet assay. Kort beskrevet blev H1299 celler udpladet i 60 mm skåle ved 4 × 10

5 celler pr skål og den følgende dag blev behandlet med 4 ug tom vektor eller NPRL2 med eller uden 3,0 uM cisplatin. Efter 72 timers inkubation blev cellelysater fremstillet ved hjælp radioimmunpræcipitationsanalyse (RIPA) /PBS-buffer (1% NP-40, 0,5% natriumdeoxycholat, 0,1% natriumdodecylsulfat [SDS]). Cellelysater (0,5 ml med en samlet proteinkoncentration på 2 mg /ml) blev præ-blokerede ved tilsætning af 15 pi protein A /protein G-Plus agaroseperler (Santa Cruz Biotechnology) og inkuberet i 15 minutter ved 4 ° C. Efter centrifugering blev præ-klarede lysater overføres til et nyt rør med 20 pi Chk1 eller Chk2 antistof og roteret i 1 time ved 4 ° C. Derefter blev 50 pi protein A /protein G-Plus agaroseperler tilsat, og roteret i 90 min ved 4 ° C. De agaroseperler blev vasket med RIPA /PBS-buffer, og en K-LISA Checkpoint Activity Kit blev anvendt ifølge producentens instruktioner. Aktivitet blev bestemt ved aflæsning af absorbansen ved dobbelte bølgelængder på 450 og 570 nm med anvendelse af en konventionel ELISA-pladelæser.

Generering af stabile kloner af lungekræft cellelinier med lille interfererende RNA-medieret Chk2 gene silencing

for at generere cellelinjer med stabil knockdown af Chk2 udtryk vi oprindeligt screenet fire korte interfererende RNA (siRNA’er) klonet ind i dobbeltsenge (U6-H1) promotor ekspressionsvektorer købt hos System Biosciences (Mountain View, CA). Kort fortalt blev vektoren spaltet med BbsI og ligeret med annealede Chk2 siRNA designet baseret på web-baserede værktøjer. Alle sense oligoer havde AAAG ved 5 ‘enden, og alle antisense-oligoer havde AAAA-sekvens ved 5’ enden. Vi inkluderede også en mutant som kontrol. Sekvenserne var som følger: CHK2Si1: 5’aaagGAACCTGAGGACCAAG3 «; CHK2ASi1: 5’aaaaCTTGGTCC TCAGGTTC3 «; CHK2Si2: 5’aaagCGCCGTCCTTTGAATA 3 ‘; CHK2ASi2: 5’aaaaTATTC AAAGGACGGCG3 «; CHK2Si3: 5’aaagAACGGTATTATACAC CHK2ASi3: 5’aaaaGTG TATAATACCGTT 3 ‘; CHK2Si4: 5’aaagAGTTTCAAGATCTTCTGTC 3 ‘; CHK2ASi4: 5’a aaaGACAGAAGATCTTGAAACT 3 ‘; CHK2Simta: 5’aaagGCTAGCTAGTCGATC 3 ‘; CHK2Simtb: 5’aaaaGATCGACTAGCTAGC3 «. Stabile kloner blev udvalgt med anvendelse af puromycin (1 ug /ml); og efter de blev etableret, blev de screenet for ekspressionsniveauer af Chk2 protein i forhold til at styre. Den klon med den bedste lyddæmpende effekt (CHK2Si1 og CHK2ASi1) blev valgt til de funktionelle studier.

Forbigående lyddæmpning af NPRL2 genekspression i lunge cancer cellelinjer.

For forbigående knockdown af NPRL2 udtryk, vi anvendte syntetiske dobbeltstrengede siRNA’er at målrette NPRL2 kodende mRNA-sekvens og de tilsvarende uforståelige siRNA’er blev anvendt som ikke-specifik kontrol. En SMART-pulje af fire On-target NPRL2-specifikke siRNA’er blev anvendt til denne undersøgelse: målsekvenserne var 5’GCAUCGAACACAAGAAGUA 3 ‘, 5’GCAAGACAGGCAUGAGCUA 3’, 5’GUACUACGGCGUUGUGACA 3 ‘, og 5’GAC CCAAGAUCACCUAUCA 3’. Disse siRNA’er blev indkøbt fra Dharmacon (Lafayette, CO). H1299-celler blev co-transficeret med NPRL2 udtrykkende plasmid og NPRL2-siRNA’er, og tomme plasmidvektor og krypterede siRNA’er blev anvendt som kontroller, henholdsvis. Celler blev først transfekteret med NPRL2 plasmidvektor under anvendelse Fugene 6 (Roche, Indianapolis, IN) med 2,5 ug DNA i 2 × 10

5 celler per brønd i en 6-brønds plade. Seks timer efter plasmid transfektion blev celledyrkningsmediet erstattet med frisk en uden antibiotika og celler blev derefter transficeret med siRNA’er vha DharmaFECT transfektionsreagens med 50 uM SiRNA kompleksdannet med 5 pi DharmaFECTper godt i den ovennævnte plade med 6 brønde. Celler blev opsamlet 24, 48, og 72 timer efter transfektion til fremstilling af råprotein lysater til Western blot-analyse.

Immunfældning-Western blot-analyser

H1299-celler blev behandlet med 4 ug tom vektor eller NPRL2 med eller uden 3,0 uM cisplatin. Efter 72 timers inkubation blev cellelysater fremstillet ved hjælp af RIPA /PBS-buffer (1% NP-40, 0,5% natriumdeoxycholat, 0,1% SDS). Efter blokering med 1 ug af normal IgG og 20 pi protein A /protein G-Plus agaroseperler (Santa Cruz Biotechnology), blev protein immunpræcipiteret fra 500 ug ekstrakter ved anvendelse af 2 ug anti-Cdc2 eller anti-cyclin B1-antistof (Santa Cruz Biotechnology) og 30 pi protein A /protein G-Plus agaroseperler i 5 timer ved 4 ° C. Agarosen blev opsamlet ved centrifugering og derefter vasket fire gange med iskold PBS-buffer. Dernæst blev immunpræcipitater resuspenderet i 1 × SDS prøvepuffer og opvarmes med 50 mM DTT ved 95 ° C i 5 minutter; Western blotting blev udført som tidligere beskrevet [20].

Analyse af cellecykluskinetikken

Ændringer i cellecykluskinetikken i tumorceller behandlet med NPRL2 med eller uden cisplatin blev analyseret ved flowcytometri (med anvendelse af en fluorescens-aktiveret cellesorterer [FACS]) under anvendelse af et APO-BrdU KIT (BD Biosciences Pharmingen). Kort beskrevet blev celler udpladet i 60 mm skåle ved 4 × 10

5 celler pr skål; den følgende dag blev cellerne behandlet med 4 ug tom vektor eller NPRL2-udtrykkende vektor med eller uden cisplatin. Ved udpegede tidspunkter blev celler høstet og fikseret i 1% paraformaldehyd. Efter inkorporering af 5-brom-2′-deoxyuridin 5′-triphosphater (BrdUTPs) blev celler visualiseret med anvendelse af FITC-mærket anti-BrdU-antistof. Mængden af ​​totalt cellulært DNA blev opnået ved farvning af celler med PI /RNase-buffer. Celler blev behandlet for FACS-analyse af terminal deoxynucleotidyltransferase-medieret deoxyuridin 5-trifosfat (dUTP) nick-end mærkning (TUNEL farvning) for at bestemme cellecykluskinetikken, som tidligere beskrevet [20].

Dyreforsøg

Alle dyr blev opretholdt og eksperimenter udføres i henhold til National Institutes of Health og institutionelle retningslinier fastlagt for Animal Core Facility på The University of Texas MD Anderson Cancer center. De anvendte dyr i denne undersøgelse var kvinder

nu /nu Salg mus (4-6 uger gamle), som blev erhvervet fra Charles River Laboratories (Wilmington, MA). Før tumorcelleinokulering blev mus udsat for 3,5 Gy bestråling af hele legemet fra en cæsium-137 strålingskilde til helt gøre immunsystemet hos nøgne mus fra afstødning af tumoren xenografting. At evaluere effekten af ​​systemisk indgivelse af NPRL2 og cisplatin i en ortotopisk model af pleural formidling, modtog musene en intrathorakal injektion (27-gauge nål) af en suspension af H322 celler ved en densitet på 2 x 10

6 celler pr 100 pi. Musene blev tilfældigt opdelt i de følgende 4 grupper: A, behandlet med LacZ; B, behandles med LacZ og cisplatin; C, behandlet med NPRL2; og D, behandlet med NPRL2 og cisplatin. . Hver behandlingsgruppe bestod af 2 mus

På dag 26, vi administreret forskellige nanopartikler (DOTAP: Chol-DNA-kompleks) intravenøst ​​i halevener alle mus i en dosis på 25 ug plasmid-DNA (LacZ eller NPRL2 plasmid) og 10 nmol DOTAP: Chol hver i 100 pi af 5% dextrose i vand per mus. I B og D, injicerede vi cisplatin (2,5 mg /kg legemsvægt) intraperitonealt sammen med nanopartiklerne. For at estimere γ-H2AX og phospho-Chk2 (Thr68) ekspression i tumorer, blev musene sscrificed 48 timer senere, og de pleurale tumorer (større end 5 mm) i hver gruppe blev tilfældigt høstet og lynfrosset. γ-H2AX ekspression blev vurderet ved anti-phospho-histon H2AX (Ser139) (1:100) antistof og æsel-anti-muse-IgG-FITC. Prøverne blev derefter monteret med Vectashield med DAPI at kontrafarve kernerne. Straks blev objektglassene undersøgt med anvendelse af et fluorescensmikroskop. Desuden blev phospho-Chk2 ekspression analyseret ved anti-phospho-Chk2 (Thr68) antistof (1:100) ved anvendelse af en Vectastain Elite ABC kit (Vector Laboratories) og blev derefter undersøgt mikroskopisk.

Statistiske analyser

Alle eksperimenter blev gentaget mindst to gange med dobbelte eller tredobbelte prøver. ANOVA og Fishers test blev anvendt til at sammenligne værdierne af test- og kontrolprøver.

P

0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. StatView 5.0 software (Abacus Concepts, Inc., Berkeley, CA) blev anvendt til alle statistiske analyser.

Resultater

Induktion af caspase aktiviteter i respons på behandling med NPRL2 og cisplatin

NPRL2 sensibiliserer cisplatin-resistente celler (H1437R) til cisplatin-induceret apoptose (figur 1A). Forøget apoptose blev påvist i alle tre NPRL2-negativ, cisplatin-resistente cellelinier behandlet med tvungen ekspression af NPRL2 og cisplatin. Som vist i figur 1A, blev apoptose induceret i 33,4%, 42,0% og 21,8% af H1437R, H1299 og H322 celler, henholdsvis efter kombinerede behandlinger. Vi brugte også Western blotting til at bestemme aktivering af caspaser i H1299 celler behandlet med tom vektor, tom vektor plus cisplatin, NPRL2 eller NPRL2 plus cisplatin (figur 1B). Caspase-3, -8 og -9 blev aktiveret kun i H1299-celler behandlet med NPRL2 og cisplatin, som det fremgår af spaltningsprodukterne. Aktivering af caspase-2 blev detekteret i celler behandlet med cisplatin eller NPRL2 såvel alene som i kombination.

(A) Induktion af apoptose i H1299-celler behandlet NPRL2 i nærvær eller fravær af cisplatin (CDDP) ved strømning cytometri-analyse med TUNEL-farvning. PBS behandlede og tom vektor (EV) behandlede celler blev anvendt som mock og negative kontroller, henholdsvis. Fejl søjler indikerer SD’er af middelværdien i tre individuelle eksperimenter (*,

P

0,05, **,

P

0,0005). (B), Aktivering af caspase kaskader i H1299-celler ved Western blot-analyse. Adskillige caspaser i H1299-celler blev undersøgt ved Western blotting 72 timer efter behandling med tom vektor (EV) (med eller uden cisplatin) eller med NPRL2 (med eller uden cisplatin). I celler behandlet med NPRL2 og cisplatin, caspase-3, -2, -8, og -9 og poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) blev spaltet. Også caspase-2 blev aktiveret ved behandling med kun NPRL2.

Aktivering af ATM og NBS1 af NPRL2

Vi brugte Western blot analyse for at vurdere aktivering af ATM i H1299 celler i respons på ektopisk aktivering af NPRL2 i nærvær eller fravær af cisplatin (figur 2A). I H1299-celler transficeret med NPRL2, vi har registreret et lavt niveau af fosfor-ATM (Ser1981), der var blevet aktiveret af ATM kinase; efter behandling med NPRL2 og cisplatin, fosfor-ATM niveau markant forøget i en tidsafhængig måde. I H1299 celler behandlet med tom vektor kontrol og cisplatin, vi har registreret nogen ændring i fosfor-ATM-ekspression sammenlignet med den ubehandlede kontrol. Vi undersøgte også ekspressionen af ​​phospho-NBS1 (Ser343) (figur 2A), som phosphoryleres af aktiveret ATM og rekrutteret til steder med DNA-skader at fremme transmission af en serie af DNA-skader signaler til nedstrøms targets. Selvom phospho-NBS1 ikke blev detekteret i H1299-celler behandlet med tom vektor og cisplatin, blev det påvist i H1299-celler behandlet med NPRL2, og i det væsentlige forøget i en tidsafhængig måde efter behandling med NPRL2 og cisplatin.

( A), effekter af ektopisk udtryk for NPRL2 på udtryk og fosforylering af ATM og NBS1 proteins.H1229 celler behandlet med en tom vektor (EV) vektor og IC

20 dosis af cisplatin (3,0 uM), NPRL2 eller NPRL2 og IC

20 dosis cisplatin blev høstet ved 24, 48 og 72 timer efter behandlingen og analyseret for ekspression af ataksi telangiectasia muteret (ATM) kinase, phospho-ATM (Ser1981), NBS1, og phospho-NBS1 (Ser343). β-actin blev anvendt som en loading kontrol. Stigninger i phospho-ATM og phospho-NBS1 blev observeret i celler behandlet med NPRL2 eller NPRL2 og cisplatin i en tidsafhængig måde, men ikke i celler behandlet med kontrol tom vektor og cisplatin. (B), Virkninger af NPRL2-specifikke siRNA (Si) om ekspression af NPRL2 og ATM-proteiner i nærvær og fravær af cisplatin (CDDP). Den scrambled siRNA (Sc) blev anvendt som en ikke-specifik kontrol.

Specificiteten af ​​NPRL2-medierede aktivering af ATM signalvejen blev yderligere bekræftet ved forsøg med gen-specifikke siRNA’er at knockdown NPRL2 ekspression i nærvær og fravær af cisplatin i disse H1299 celler (figur 2B). Ektopisk aktivering af NPRL2 i NPRL2-deficiente H1299 celler aktiveret ATM, som indikeret ved opreguleret phospho-ATM-ekspression ved 24 timer og 48 timer efter transfektion i både nærvær og fravær af cisplatin. Knockdown af NPRL2 udtryk ved NPRL2-specifikke siRNAs reduceres eller mindsket NPRL2-medierede opregulering af phospho-ATM udtryk, sammenlignet med dem behandlet scrambled siRNA’er kontrollen ved de samme tidspunkter.

NPRL2 øger ekspressionen af ​​γH2AX

In vitro

in vivo

Vi brugte Western blotting til et tidsforløb evaluering af γ-H2AX proteinekspression (figur 3A). I H1299 celler behandlet med tom vektor og cisplatin eller NPRL2, γ-H2AX protein niveauer steg og var den samme ved 24 og 48 timer efter behandling. Men ved 72 timer, de γ-H2AX protein niveauer i celler behandlet med tom vektor og cisplatin faldet markant, mens niveauet i celler behandlet med NPRL2 forblev næsten de samme som dem på 24 h og 48-h tidspunkter. I celler behandlet med en kombination af NPRL2 og cisplatin, γ-H2AX proteinniveauer steg på en tidsafhængig måde.

H1229-celler behandlet med en tom vektor og IC

20 dosis cisplatin (3,0 uM) , NPRL2 eller NPRL2 og IC

20 dosis cisplatin blev høstet ved 24, 48 og 72 timer efter behandling. (A) Western blot viser bemærkelsesværdigt forbedret ekspression af γ-H2AX i celler behandlet med NPRL2 og cisplatin sammenlignet med celler behandlet med tom vektor og cisplatin. (B) γ-H2AX ekspression blev undersøgt ved 48 timer efter behandling ved immunfluorescensfarvning og flowcytometrisk analyse. γ-H2AX ekspression blev detekteret i celler behandlet med tom vektor og cisplatin eller NPRL2 men ikke i celler behandlet med kun tom vektor, og denne ekspression blev dramatisk forøget i celler behandlet med NPRL2 og cisplatin. Forstørrelse: × 800. Mean fluorescein (FITC) intensitet blev også undersøgt ved 24, 48, og 72 timer efter behandling. På disse tre tidspunkter, γ-H2AX udtryk i celler behandlet med NPRL2 og cisplatin var betydeligt højere end i celler i alle andre behandlinger (

P

0,02 eller

P

0,0005 ). Barer, SDS af middelværdien i to individuelle eksperimenter. (C) γ-H2AX ekspression blev analyseret ved immunfluorescensfarvning i en ortotopisk model af H322 pleural udbredelse, som beskrevet i afsnittet Materialer og fremgangsmåder. De pleurale tumorceller fra mus behandlet med LacZ og cisplatin eller NPRL2 blev svagt farvet; i modsætning hertil blev γ-H2AX hyperexpressed i celler behandlet med NPRL2 + cisplatin. Forstørrelse:. × 400

Næste, immunfluorescensfarvning og flowcytometrisk analyse for γ-H2AX udtryk ved 48 timer efter behandlingen blev udført (figur 3B). Ekspression af γ-H2AX proteinekspression i kernerne i celler behandlet med både NPRL2 og cisplatin var forøget sammenlignet med den i alle andre grupper. Desuden var den gennemsnitlige FITC intensitet NPRL2 og cisplatin-behandling blev signifikant forhøjet sammenlignet med alle andre behandlinger (

P

0,02). Under tidsforløbet

γ-H2AX proteinekspression var derefter målt i et humant NSCLC H322 orthotopisk pleural tumor xenograft i mus. Den H322 cellelinien er NPRL2-negative og cisplatin-resistente. På dag 26 efter intratorakal injektion af H322-celler, vi administreret NPRL2 eller LacZ nanopartikler i halevenen med eller uden intraperitoneal cisplatin injektion. De pleurale tumorer fra mus behandlet med LacZ sammen med cisplatin eller NPRL2 svagt farvet for γ-H2AX (figur 3C). Tumorer behandlet med NPRL2 og cisplatin viste høje niveauer af γ-H2AX (figur 3C).

Aktivering af Chk1 og Chk2 af NPRL2 og cisplatin

in vitro

in vivo

Vi undersøgte phosphoryleringen af ​​Chk1 på Ser-345 og Chk2 på Thr-68 ved Western blotting (figur 4A). I H1299 celler behandlet med tom vektor og cisplatin eller NPRL2, phosphoryleret Chk1 steg på en tidsafhængig måde. I celler behandlet med NPRL2 og cisplatin, blev Chk1 udtryk stærkt forbedret. Selvom phosphoryleret Chk2 ikke blev registreret i H1299-celler behandlet med tom vektor og cisplatin, det klart øget i en tidsafhængig måde i celler behandlet med NPRL2 eller NPRL2 med cisplatin. Vi evaluerede phospho-Chk2 proteinekspression i de ortotopisk tumorxenotransplantater ved immunhistokemisk farvning af tumorceller fra hver gruppe (figur 4B). Tumorcellerne fra musene behandlet med LacZ eller LacZ og cisplatin havde meget lavt niveau farvning. For tumorer behandlet med NPRL2 blev phospho-Chk2 ekspression detekteres på et lavt niveau (figur 4B). Behandling med kombination NPRL2 og cisplatin induceret høj phospho-Chk2 udtryk.

(A) H1229 celler behandlet med tom vektor og IC

20 af cisplatin (3,0 uM), NPRL2 eller NPRL2 + med IC

20 dosis cisplatin blev høstet ved 24, 48 og 72 timer efter behandlingen og analyseret for ekspression af Chk1, P-Chk1 (Ser345), Chk2, og P-Chk2 (Thr68). I celler behandlet med tom vektor og IC

20 dosis af cisplatin eller NPRL2, P-Chk1 steg på en tidsafhængig måde. I modsætning hertil dem behandlet med NPRL2 og IC

20 dosis af cisplatin, P-Chk1 blev dramatisk forbedret. Selvom P-Chk2 ikke blev detekteret i H1299-celler behandlet med tom vektor og IC

20 dosis cisplatin, blev det klart øget i en tidsafhængig måde i dem behandlet med NPRL2 eller NPRL2 + IC

20 dosis cisplatin. (B) P-Chk2 udtryk blev immunhistokemisk analyseret i en ortotopisk model af H322 pleural udbredelse, som beskrevet i Materialer og metoder sektion. P-Chk2 ekspression var lidt detekteret i pleurale tumorceller fra mus behandlet med NPRL2 nanopartikler, men ikke i dem behandlet med LacZ eller LacZ + cisplatin. I modsætning hertil behandling af NPRL2 nanopartikler og cisplatin fremkaldte høje phospho-Chk2 ekspression i tumorceller. Forstørrelse: × 400. (C) kinaseaktiviteten af ​​Chk1 og Chk2 i H1299-celler behandlet med tom vektor + IC

20 dosis cisplatin, NPRL2 eller NPRL2 + IC

20 dosis cisplatin blev analyseret med anvendelse af en K-LISA Checkpoint Activity Kit , et enzymbundet immunosorbentassay (ELISA) -baseret aktivitet assay. Chk1-aktivitet var større i celler behandlet med NPRL2 + cisplatin end i celler behandlet med tom vektor eller tom vektor + cisplatin (

P

0,003). Chk2 kinase aktivitet blev stærkere forbedret i celler behandlet med NPRL2 eller NPRL2 + cisplatin end i celler behandlet med tom vektor eller tom vektor + cisplatin (

P

0,0001). Barer, SDS af middelværdien i fire individuelle eksperimenter.

Vi målte også kinaseaktiviteten af ​​Chk2 og Chk1 i H1299-celler behandlet med NPRL2 med eller uden cisplatin med brug af K-LISA Checkpoint Activity Kit , en ELISA-baseret kinaseaktivitet assay. Chk2 kinase aktivitet i celler behandlet med NPRL2 eller NPRL2 og cisplatin var stærkt forøget, sammenlignet med aktivitet i celler behandlet med tom vektor med eller uden cisplatin (

P

0,0001) (figur 4C). Chk1-aktivitet i celler behandlet med NPRL2 og cisplatin var stærkere end i celler behandlet med tom vektor med eller uden cisplatin (

P

0,003). (Figur 4C)

For yderligere at definere natur Chk2 interaktion med NPRL2, vi analyserede effekten af ​​NPRL2 og Chk2 udtryk på apoptose ved hjælp Chk2-specifikke siRNA (figur 5A) til at vælte Chk2 udtryk i cisplatin-resistente H1437 celler (H1437R) (Figur 5B). β-actin blev anvendt som en loading kontrol.