PLoS ONE: Tetra-O-methyl nordihydroguaiaretsyre Groft Undertrykker Cancer Metabolisme og Synergistisk Fremkalde Stærk Anticancer aktivitet i kombination med etoposid, Rapamycin og UCN-01

Abstrakt

evne Tetra

O

methyl nordihydroguaiaretsyre (M

4 N) til at fremkalde en hurtig celledød i kombination med etoposid, Rapamycin eller UCN-01 var undersøgt i LNCaP-celler, både i cellekultur og dyreforsøg. Mus behandlet med M

4N lægemiddelkombinationer med enten etoposid eller Rapamycin viste ingen tegn på tumor og havde en 100% overlevelsesrate 100 dage efter tumorimplantation. Til sammenligning alle andre køretøjer eller enkelt lægemiddel behandlede mus undladt at overleve længere end 30 dage efter implantation. Denne synergistiske forbedring af anticancervirkning blev også bekræftet i mere end 20 cancercellelinier. I LNCaP-celler, M

4N viste sig at reducere cellulær ATP indhold, og undertrykke NDUFS1 ekspression mens inducere hyperpolarisering af mitochondriemembranpotential. M

4N-behandlede celler manglede autophagy med reduceret udtryk for BNIP3 og ATG5. For at forstå mekanismerne i denne anticancer aktivitet af M

4N, effekten af ​​dette stof på tre kræft cellelinier (LNCaP, ASPC-1, og L428 celler) blev undersøgt yderligere via transkriptom og metabolomics analyser. Metabolomiske Resultaterne viste, at der var reduktioner på 26 metabolitter væsentlige for generering og /eller produktion af cellulære komponenter energi til fælles med disse tre cellelinjer efter 8 timers M

4N behandling. Deep RNA-sekventering analyse viste, at der var seksten gener, hvis udtryk viste sig at være moduleret efter 6 timers M

4N behandling på samme måde i disse tre cellelinier. Seks ud af disse 16 gener var funktionelt relateret til de 26 metabolitter beskrevet ovenfor. En af disse op-regulerede gener koder for CHAC1, et nøgleenzym påvirker stress veje gennem dens nedbrydning af glutathion. Faktisk M

4N fandtes at undertrykke glutathion indhold og inducere reaktive oxygenarter produktion. Dataene samlet indikerer, at M

4N har dybtgående specifikke negative virkninger på en bred vifte af kræft stofskifte understøtter brugen af ​​M

4 N kombination til kræftbehandling

Henvisning:. Kimura K, Huang RCC ( 2016) Tetra

O

Methyl nordihydroguaiaretsyre Groft Undertrykker Cancer Metabolisme og Synergistisk Fremkalde Stærk Anticancer aktivitet i kombination med etoposid, Rapamycin og UCN-01. PLoS ONE 11 (2): e0148685. doi: 10,1371 /journal.pone.0148685

Redaktør: Han-Chung Wu, Academia Sinica, TAIWAN

Modtaget: 22 oktober, 2015; Accepteret: 20 Jan 2016; Udgivet: 17 februar, 2016

Copyright: © 2016 Kimura, Huang. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer. Undersøgelserne blev forelagt NCBI bioprøven databasen og blev tildelt følgende bioprøven Tiltrædelse: SAMN04407347 (LNCaP-M4N-RNA), SAMNO4407348 (LNCaP-Ctrl-RNA), SAMN04407349 (AsPC-1-M4N-RNA), SAMN04407350 (AsPC- 1-Ctrl-RNA), SAMN04407351 (L42 8-M4N-RNA) og SAMNO 4407 3 52 (L428-Ctrl-RNA)

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra National Institutes of Health ( R01DE12165), Biocuremedical, LLC, og Dorothy Yen Trust (P 690-C25-2407) til RCH. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Ru Chih C. Huang er en hovedstol opfinder og Kotohiko Kimura er en opfinder af et patentansøgning “Termeprocol med 7-hydroxystaurosporin” (PCT WO 2011/103586 A2 – patent tilladt 1 april 2015). Dr. Huang er også en hovedstol opfinder af flere JHU patenter på M4N. JHU har lejet stoffet (M4N, Terameprocol) relaterede patenter, men ikke denne PCT WO 2011/103586 A2 til Erimos Pharmaceuticals indtil 2017. Dette ændrer ikke forfatternes overholdelse PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Indledning

Vi har tidligere rapporteret, at tetra

O

methyl nordihydroguaiaretsyre (M

4N), også kendt som EM1421 og terameprocol, besad antivirale og anti-cancer aktiviteter [ ,,,0],1-4], og at M

4N kunne være potentielt nyttig som et anticancerlægemiddel. Vi viste også, at en af ​​de vigtigste farmakologiske aktiviteter af M

4N var at inhibere aktiviteten af ​​SP1 transkriptionsfaktor ved binding til GC-rige regioner (SP1 konsensussekvenser) af genpromotorer kompetitivt med SP1 [4]. Det blev også konstateret, at M

4N, på grund af denne aktivitet, var i stand til at undertrykke SP1-regulerede

CDK1

ekspression og til at forårsage standsning af cellecyklus ved G2-fasen af ​​cellens cyklus [4], som delvist givet en forklaring til M

4N induceret anticanceraktivitet, som ureguleret vækst anses for at være et af kendetegnene ved kræft. Desuden Wang et al. viste, at overekspression af SP1 lettet udviklingen og progressionen af ​​gastrisk cancer [5], hvilket yderligere antyder, at undertrykkelse af SP1-reguleret transkription kunne inducere anticancer aktiviteter. Andre end disse undersøgelser af transskription hæmning, har der været, men et par undersøgelser relateret til de farmakologiske virkninger af M

4N. Mest bemærkelsesværdigt Pardini et al. viste, at nordihydroguaiaretsyre (NDGA, en precursor forbindelse med M

4N) inhiberede mitokondrie elektron transportsystem og undertrykt oxidativ phosphorylering [6-7]. NDGA var kandidat anticancermiddel, men det blev til sidst vist sig at være klinisk uhensigtsmæssigt på grund af sin betydelige bivirkninger. På grund af ligheden i molekylær struktur mellem M

4N og NDGA (Fig 1A), disse oplysninger vedrørende NDGA er relevante for vores undersøgelser af M

4N. Samlet set har disse tidligere fund af M

4N tyder på, at M

4N måske have flere farmakologiske aktiviteter.

A. Molekylære strukturer af nordihydroguaiaretsyre (NDGA) og tetra-O-methyl nordihydroguaiaretsyre (M

4N). B: Synergistisk celledødsinduktion i LNCaP vævskulturceller. C: kontrol, E: Etoposid (20 uM), Ra: Rapamycin (20 uM), U: UCN-01 (2 uM), M: M

4N (80 uM), ME: M

4N + etoposid, MR: M

4N + Rapamycin, MU: M

4N + UCN-01. Celledøden blev målt ved TUNEL-assay og trypanblå eksklusion assay ved 24 timer efter behandling. Data er præsenteret som middelværdi ± SD i triplikat. C: En Chou-Talalay plot for TUNEL-positive celledød induceret af kombinationsbehandlinger i LNCaP celler. Kombination index (CI) 1, 1, og 1 indikerer synergisme, additiv effekt, og antagonisme. D: Virkning af kombinationsbehandlinger med M

4N med etoposid eller Rapamycin på overlevelsen af ​​nøgne (nu /nu) mus orthotropically implanteret med LNCaP-tumorer. Procentdelen af ​​mus, der har overlevet fra den dato, efter podning med tumoren blev vist for hver gruppe.

M

4 N er i øjeblikket i fase I /II kliniske forsøg med patienter med forskellige fremskreden kræft [8 , 9]. Resultaterne af disse kliniske forsøg hidtil viser, at M

4N har en vis grad af anticanceraktivitet, men var ikke i stand til at inducere remission i nogen af ​​disse patienter med fremskredne cancerformer. En af de hyppigst forsøgt strategi for at øge anticancer effekt af kemoterapi narkotika er kombinationsbehandling med en eller flere passende udvalgte lægemidler [10]. Et vigtigt resultat fra de kliniske forsøg med M

4N er, at toksiciteten af ​​lægemidlet var meget lav [8, 9]. Patienterne var i stand til at tåle høje doser af M

4N med minimale bivirkninger, som gør dette stof meget velegnet til at blive brug i multidrug behandlinger (for eksempel LD

50 M

4N for mus er større end 1000 mg /kg, mens den for NDGA er kun 75 mg /kg [11, 12]). Optimering af multidrug behandlinger kræver dyb viden om farmakologiske mekanismer anticancer handlinger lægemidler, der skal anvendes i kombination. Den præcise mekanisme for anticancer aktivitet af M

4N er stadig ukendte. Vanskeligheden ved at forstå farmakologien af ​​M

4 N er rodfæstet i det faktum, at der kan forventes dette stof til at påvirke flere biokemiske aktiviteter siden sin farmakologiske mål, SP1 transskription faktor, styrer en lang række hus-holde gener [13]. Som en kendsgerning, en undersøgelse af 22,633 kendte gener i Ensemble Human Genome database (http://www.ensembl.org/index.html) indikerede, at lidt over halvdelen (52,5%) indeholdt SP1 bindende motiv i deres umiddelbare (500bp) opstrøms regioner.

i denne undersøgelse vi først udøvede vores bedste for at finde visse lægemiddelkombinationer med M

4N der opnåede lovende anticancer effekt i vævskultur og mus xenograft eksperimenter. Gennem disse bestræbelser, vi med succes opdaget, at M

4N kombinationsbehandlinger med etoposid og Rapamycin var i stand til fuldstændig at udrydde orthotopisk implanteret LNCaP afledte tumorer og metastase i nøgne mus. M

4N kombination behandlede mus havde en 100% overlevelse 100 dage efter tumor implantering. Til sammenligning alle andre køretøjer eller enkelt lægemiddel behandlede mus undladt at overleve længere end 30 dage efter implantation. Dette illustrerede den ekstraordinære potentiale evne M

4N at forbedre anticancer effekt ved kombinationsbehandlinger. For at forstå de farmakologiske mekanismer involveret, vi undersøgte de biokemiske og fysiologiske virkninger af M

4N behandling på kræftceller med hjælp af high-throughput screeningsmetoder, såsom GC /LC-MS (gaskromatografi /væskekromatografi-massespektroskopi) -baseret metabolit assay og dyb RNA-sekventering. Da målet molekyler af M

4N kunne være mange på grund af karakteren af ​​dets farmakologiske aktivitet som en SP1 inhibitor, til high-throughput screening med sin magt indsamle oplysninger om status for et stort antal metabolitter og mRNA på engang var meget nyttigt at dechifrere den komplekse karakter af M

4N aktivitet. Vores undersøgelse har hidtil vist, at der var en væsentlig reduktion af metabolitter er essentielle for tumorvækst i alle tre cancercellelinier undersøges efter en kort periode med M

4N behandling, og at synergistiske induktion af caspase-spaltning og hurtig reaktive oxygenarter produktion opstod, når M

4N blev brugt med anden anticancer narkotika i kombination.

Resultater

Synergistisk induktion af anticancer effekt af M

4N-baserede kombinationsbehandlinger

Vi evaluerede brugen af ​​M

4N i flere stof kombinationsbehandlinger bruger cellekultur eksperimenter og nøgen mus xenografundersøgelser. I disse forsøg anvendte vi LNCaP human prostatacancer-cellelinie som en selvstændig eksperimentel materiale, da det har været anvendt i dyremodeller for metastatisk prostatacancer [14]. Desuden er det blevet vist, at kræft ofte forekommet genetiske mutationer i LNCaP-cellelinien [15], hvilket tyder denne cellelinie opfører sig på samme til cancere i kliniske omgivelser som ofte undergår forskellige genmutationer under deres progression [16]. Som et pilotforsøg for at fastlægge de mest hensigtsmæssige lægemidler, der skal anvendes i kombination med M

4 N for kliniske anvendelser, valgte vi tre lægemidler mod cancer, nemlig etoposid [17], rapamycin [18], og UCN-01 [19] og evalueret anticancer effekt af kombinationsbehandlinger med disse lægemidler i LNCaP celler ved hjælp af både den TUNEL-analysen og trypanblå eksklusion assay. Resultaterne (Fig 1B) viste, at M

4N synergistisk celledød med alle tre lægemidler mod cancer undersøgt. En Chou-Talalay plot [20] bekræftede, at alle kombinationsbehandlinger var stærkt synergistisk (Fig 1B). Desuden er mængden af ​​celledød detekteret ved trypanblå eksklusion assay oversteg langt detekteret ved TUNEL-assay (Fig 1A), hvilket indikerer, at TUNEL-negative celledød spillede en vigtig rolle i den synergistiske celledød, især i M

4N kombinationsbehandling med Rapamycin. De kombinationsbehandlinger var effektive i et panel af kræft cellelinjer, som blev valgt til deres genetiske diversitet (S1 Fig). Synergistisk død blev imidlertid ikke observeret i HL-1, en normal mus hjertemuskel cellelinie (vores upublicerede data). Dosisreduktion indeks (DRI) for LNCaP celler blev vist i S2 Fig. Fordelen ved de kombinationsbehandlinger blev også vurderet ved hjælp xenograft mus der bærer LNCaP tumorer. Overlevelsesraten kurve (Fig 1D) indikerede, at alle de LNCaP tumorbærende mus, der modtog en kombination af M

4N med etoposid eller Rapamycin overlevede ud over 100 dage efter tumorimplantation, mens ingen af ​​dem behandlet med en enkelt lægemiddel overlevede ud over 34 dage på grund af flere metastaser [21]. Derudover flere andre xenograft mus eksperimenter bekræftede, at M

4N-baserede kombinationsbehandlinger var effektive i mange andre end LNCaP celler [22] kræft cellelinjer. Den samlede data viste en overlegenhed kombinationsbehandlinger i forhold til enkelte lægemiddelbehandlinger, og også det viste, at M

4N syntes at arbejde godt sammen med forskellige lægemidler, hvis farmakologiske mekanismer deres anticancer aktivitet var meget forskellige fra hinanden.

den kombinerede behandling med M

4N inducerer caspase-7 spaltning

at udforske mulige involvering af caspaser i celledød mekanismer M

4N kombinationsbehandlinger [23] undersøgte vi caspase spaltning profil i LNCaP celler efter single-drug (M

4 N, etoposid, Rapamycin eller UCN-01) og M

4N kombination (M

4 N /etoposid, M

4 N /Rapamycin, og M

4N /UCN-01) behandlinger ved Western blot-analyse. Efter single-medicinsk behandling, UCN-01, men ikke etoposid eller Rapamycin stærkt aktiveret caspase-9, -3 og -7 (Fig 2AA og 2ab). På den anden side blev kun en lille mængde af caspase-9 og -3 aktivitet påvist efter nogen af ​​M

4N kombinationsbehandlinger (fig 2AA). Tilsyneladende, M

4N forstyrrede evne UCN-01 for at aktivere caspase-9 og -3. Tværtimod western blot analyse af caspase-7 (fig 2AA) viste, at M

4N forhindrede ikke spaltning af denne caspase af UCN-01. Endvidere kløvning af caspase-7 forekom også efter M

4N /Etoposid behandling og i mindre grad efter M

4N /Rapamycin behandling (fig 2AA og 2ab). Den kolorimetriske assay for caspase-7-aktivitet (Fig 2B) bekræftede resultaterne af Western blot analyse (fig 2AA og 2ab). Disse data generelt tilkendegivet, at kombinationsbehandlinger aktiveret caspase-7 meget mere end en enkelt medicinsk behandling. Interessant enten UCN-01 behandling eller nogen af ​​de M

4N kombinationsbehandlinger viste to forskellige caspase-7-fragmenter, en stor (P30) og en lille (p17) fragment (fig 2AA og 2ab). Boucher

et al

. viste, at en af ​​de vigtigste funktioner i caspase-7 var at spalte og inaktivere poly-ADP ribose polymerase (PARP) [24]. Derfor undersøgte vi spaltningen af ​​PARP i celler behandlet med M

4n-baserede kombinationsbehandlinger. Dataene (Fig 2AA) viste, at den samlede blev observeret en signifikant større PARP spaltning for cellerne behandlet med kombinationsbehandlinger end enkelt medicinsk behandling. Desuden viste også de data, kombinationsbehandlingen af ​​M

4N med etoposid eller UCN-01 viste en større mængde af både P89 og p24-fragmenter end med Rapamycin. Disse data er aftalt med caspase-7-relaterede data (Fig 2A og 2B), hvilket indikerer, at caspase-7 aktivitet var større med kombinationsbehandling indeholdende etoposid eller UCN-01 end med Rapamycin

AB:. Analyse af caspase -afhængige celledød mekanismer fremkaldt af kombinationsbehandlinger af M

4 N med etoposid, Rapamycin eller UCN-01. Aa Ab: Spaltning af caspase-3, -4, -7, og -9 sammen med poly-ADP ribose polymerase (PARP) i LNCaP-celler behandles med kombinationsbehandling af 17 timer. p-actin blev anvendt som kontrol. B: Caspase-7 enzymatisk aktivitet i LNCaP-celler behandles med kombinationsbehandling af 13 timer. Data er præsenteret som middelværdi ± SD i triplikat. A B: C: kontrol, E: Etoposid (10 uM), Ra: Rapamycin (10 uM), Ra30μM: Rapamycin (30 uM), U: UCN-01 (2 uM), M4N: M

4N (80 uM ), og Casp: Caspase. C: Effekt af kombinationsbehandlinger på mitochondriemembranpotential (ΔΨ

m). LNCaP-celler blev behandlet med M

4N (80 uM) i kombination med etoposid (10 uM), Rapamycin (10 uM) eller UCN-01 (2 uM) i 4 timer. Den ΔΨ

m blev målt under anvendelse JC-1 farvestof. Billedet viser de nøgletal fremkommer ved at dividere intensitet ved 568 nm-excitation lys (J-aggregater) ved at ved 488 nm-excitation lys (J-aggregater + monomer). Farven bar er vist i højre side af figuren (H: høj, L: lavt forhold).

Aktiveringen af ​​mitokondrier-associerede caspase-9/3-afhængig celledød mekanisme er normalt forbundet med depolarisering af mitokondrie membran potentiale (ΔΨ

m) [25]. Derfor næste udført vi eksperimenter under anvendelse JC-1 farvestof til at måle ΔΨ

m (fig 2C). De JC-1 dye eksperimenter viste, at UCN-01 behandling, men ikke etoposid eller Rapamycin behandling induceret depolarisering af ΔΨ

m i en kort periode. Endnu vigtigere er det også vist, at M

4N induceret hyperpolarisering af ΔΨ

m og forhindrede depolarisering af ΔΨ

m fremkaldt af UCN-01.

M

4N behandling nedregulerer autophagy

autophagy er en proces, nedbryder beskadigede eller unødvendige cellulære bestanddele med henblik på genbrug dem som ressourcer, og aktiveres ved næringsberøvelse betingelser som en del af cellulære forsvarsmekanismer [26]. LC3B-II-ekspression er almindeligt kendt at korrelere godt med autophagic aktivitet og anvendes som en indikator for autofagi [27] .western blot-data (Fig 3A) viste, at M undertrykte LC3B-II netto formation

4N næsten fuldstændigt, hvilket viser, at M

4N hæmmede autofagi. Næste vi undersøgte effekten af ​​M

4N på ekspressionen af ​​BNIP3 af det nordlige og western blotting. BNIP3 er et BH3 kun protein og er kendt for at være involveret i både apoptose og autofagi [28-30]. Fordi BNIP3 er induceres af hypoxi, var dens udtryk undersøgt under både normoxiske og hypoxiske betingelser. Behandling med M

4 N i 6 timer effektivt reducerede både mRNA og protein udtryk for BNIP3 (Fig 3B og 3C), hvilket indikerer, at M

4N undertrykt

BNIP3

udtryk på det transskriptionelle niveau. Dataene viste også, at M

4N var i stand til at undertrykke den basale samt hypoxi-induceret ekspression af

BNIP3

til næsten nul (fig 3C). Derudover Western blotting (fig 3C) viste, at M

4N ændrede ikke ekspressionen af ​​BNIP3L, et protein relateret til BNIP3 [28]. Effekten af ​​M

4N på ekspressionen af ​​ATG5, et centralt element for autophagy maskiner [31], blev derefter undersøgt og western blot analyse (Fig 3D) viste, at M

4N betydeligt undertrykt ATG5 udtryk i mindre end 18 timer . Dataene viste således, at M

4N undertrykt autophagy ved at modulere flere cellulære komponenter afgørende for autophagic mekanismer som ATG5 og BNIP3

A:. Virkning af M

4N på autofagi i LNCaP celler. Udtrykket af LC3B-I og II blev undersøgt af western blotting i LNCaP celler behandlet med kombinationsbehandlinger af M

4 N med etoposid, rapamycin, eller UCN-01 i 18 timer i nærværelse af bafilomycin A

1 ( 100 nM), en autophagosome nedbrydning inhibitor. Bafilomycin A

1 blev sat til at måle netto aktivitet autofagi. Koncentrationerne af M

4N, etoposid, rapamycin, og UCN-01 var 80, 20, 20, og 5 uM. C: Kontrol, E: etoposid, Ra: rapamycin, U: UCN-01. B: mRNA udtryk for

BNIP3

gen, undersøgt ved northern blotting, i LNCaP celler behandlet med M

4 N (80 uM) under normoxisk eller hypoxisk betingelse for 2 eller 6 timer. Hyp: hypoksisk tilstand. C: Udtrykket af BNIP3 og BNIP3L, undersøgt af western blotting, i LNCaP celler behandlet med M

4 N (80 uM) under normoxisk eller hypoxisk betingelse for 6 eller 18 timer. D: Udtrykket af ATG5, undersøgt af western blotting, i LNCaP celler behandlet med M

4 N (80 uM) i 18 timer. β-Actin blev anvendt som kontrol.

M

4N bredt modulerer metaboliske veje

For at forstå den mekanisme af synergi i anticancer effekt (figur 1, S1 Fig) , cellulære indhold biokemiske metabolitter og profiler til mRNA blev undersøgt søger efter mulige fysiologiske ændringer efter M

4N behandling i LNCaP menneskelig prostatacancer, aSPC-1 human bugspytkirtelkræft, og L428 menneskelige Hodgkin lymfom celler. Først undersøgte vi effekten af ​​M

4N på metabolit indholdet i disse celler (udført af Metabolon, Co. Ltd) [32]. Den metabolit assay (S1 Table) viste brede påvirkninger af M

4N om forskellige væsentligste metaboliske veje. Da manglen på bestemte metabolitter har mere betydelige virkninger på cellulær fysiologi end den overflod af dem, valgte vi metabolitterne hvis cellulære indhold blev konsekvent reduceret med M

4N i mindst to ud af tre cellelinjer og unchange eller ubestemte i tredje (figur 4).

LNCaP, AsPC-1 og L428-celler blev behandlet med M

4N (80 pm) i 8 timer og metabolit-indholdet af prøverne blev målt ved LC /GC massespektroskopi ved Metabolon (S1 tabel). Blandt de undersøgte metabolitter, kun de metabolitter, hvis indhold var signifikant (p ≤ 0,05) undertrykt af M

4N i mindst to ud af tre cellelinier blev udvalgt og er opført her med den yderligere betingelse, at effekten af ​​M

4N om indholdet af metabolitter i den tredje cellelinje var en undertrykkelse, ingen signifikant ændring, eller ikke undersøgt. ‘M /C «angiver forholdet Ved metabolisk indholdsfortegnelsen for prøverne treated med M

4N vs. kontrol. N.A. angiver ‘data ikke er til rådighed «. Undtagelserne for disse regler var ADP og UDP-glucose (hvis indhold blev begge undertrykt af M

4N i to af de tre cellelinier, men forskellen var statistisk signifikant kun i en af ​​de to cellelinier. I tredje cellelinie data var ikke tilgængelig). Tallene for forholdet skraveret med grønt viser, at metabolit indhold var statistisk mindre i de behandlede prøver end kontrolgruppen, mens dem uden nuancer indikerer, at der ikke var en statistisk forskel mellem kontrolgruppen og de behandlede prøver.

Mange TCA cyklus-relaterede metabolitter (citrat, succinat, fumarat og malat) blev forårsaget af M

4N behandling (figur 4). Kun indholdet af α-ketoglutarat blev steg svagt med M

4N blandt TCA-cyklus-relaterede metabolitter (S1 tabel). Virkningen af ​​M

4N på glucolysis /glukoneogenese-relaterede metabolitter blev variabel afhængigt af cellelinjen (S1 Table) selv om indholdet af glucose-6-phosphat og glucose-1-phosphat konsekvent blev reduceret med M

4N behandling (figur 4). Glucose-1-phosphat omdannes til UDP-glucose ved glucosyltransferase reaktioner med UTP. Indholdet af både UDP-glucose og UTP blev reduceret med M

4N samt (figur 4), hvilket indikerer, at metabolisms relateret til glucose-6-phosphat /glucose-1-phosphat /UDP-glucose blev samlet undertrykt af M

4N. Indholdet af 3-phosphoglycerat, et centralt metabolit i glucolysis /glukoneogenese pathway, var signifikant forhøjet ved M

4N i LNCaP-celler, men ikke i AsPC-1 eller L428 celler, mens indholdet af pyruvat, som også er en nøgle glycolysen metabolit, var signifikant forhøjet ved M

4N i aspC-1 og L428 celler, men ikke i LNCaP celler (S1 tabel). Dette indikerede, at skønt virkningen af ​​M

4N på glycolyse-relaterede metabolitter var variabel afhængigt af cellelinier, M

4N stå glykolyse i alle tre cellelinier undersøgt og akkumuleret nogle glycolyse-relaterede metabolitter, såsom 3-phosphoglyceratkinase og pyruvat. Imens indholdet af laktat konsekvent reduceret med M

4N behandling (Fig 4), hvilket indikerede, at konvertering fra pyruvat til laktat blev undertrykt af M

4N. Som konklusion, data relateret til kulhydrat metabolisme (Fig 5A) generelt viste, at M

4N reducerede indholdet af TCA cyklus-relaterede metabolitter, mens akkumulerende visse glycolyse-relaterede metabolitter, og dermed fremkaldt cataplerosis (cataplerosis defineres her som en metabolisk tilstand, som opstår under mangel på TCA cyklus-relaterede metabolitter) [33]

A:. Et skema for glycolysis-, TCA-cycle-, og mitokondrier elektron transportsystem-relateret metabolisk vej. De rå data af metabolitten assayet er vist i S1 tabel. Udvælgelsen af ​​S1 tabel kan findes i figur 4. De opadrettede pile indikerer, at indholdet af metabolitterne forbundet med disse pile var signifikant (p ≤ 0,05) induceret af M

4N i mindst to ud af tre cellelinier (LNCaP, AsPC-1, og L428 celler) under den yderligere betingelse, at effekten af ​​M

4N på indholdet af disse metabolitter i tredje cellelinje var en induktion uden statistisk signifikant forskel, ingen signifikant ændring, eller ikke undersøgt . Imens de nedad pegende pile viser, at indholdet af de metabolitter, der er forbundet med disse pile var signifikant (p ≤ 0,05) undertrykt af M

4N i mindst to ud af tre cellelinier (LNCaP, ASPC-1, og L428 celler) med den yderligere betingelse, at virkningen af ​​M

4N på indholdet af disse metabolitter i tredje cellelinje var en undertrykkelse uden statistisk signifikant forskel, ingen signifikant ændring, eller ikke undersøgt. Undtagelserne for disse regler er glukose-6-fosfat (hvis indhold blev undertrykt af M

4 N i alle tre cellelinjer, men forskellen var statistisk signifikant kun i L428 celler), 3-phosphoglycerat (hvis indhold var signifikant induceret af M

4N i LNCaP men ikke i aspC-1 og L428 celler) og pyruvat (hvis indhold blev signifikant induceret af M

4N i aspC-1 og L428-celler, men undertrykte signifikant i LNCaP-celler). 3-phosphoglycerat og pyruvat er markeret med tilhørende opadrettede pile, fordi dataene (S1 tabel) indikerede, at M

4 N akkumuleret disse metabolitter og gået i stå glykolyse, selv hvordan M

4N påvirket disse metabolitter blev variabel afhængigt af cellelinje (se teksten). Virkningen af ​​M

4N på ATP-indholdet i hele celler er vist i fig 6A. Virkningen af ​​M

4N på NDUFS1 ekspression er vist i fig 6C. Resultatet indikerer forøgelsen af ​​mRNA-ekspression af phosphoenolpyruvatcarboxykinase 2 (PCK2) og asparagin syntase (NMU) af M

4N (80 uM) behandling i 6 timer var fra dyb RNA-sekventering analyse vist i tabel 1. B: Et skema for lipid metaboliske vej. Betydningen af ​​de op- og nedad pegende pile i dette skema er de samme som i skemaet for glucolysis-, TCA-cycle-, og mitokondrier elektron transportsystem-relateret metabolisk vej (Fig 5A). Langkædede fedtacyl-carnitin indbefatter palmitoylcarnitin (16: 1) og oleoylcarnitine (18: 1). Når fedtsyrer nedbrydes gennem β-oxidation cyklus, de skal konverteres til acyl-carnitiner, der skal transporteres inde i mitokondrierne. de data viste således, at M

4N skal undertrykke β-oxidation cyklus ved at reducere produktionen af ​​langkædede acyl-carnitiner.

De metabolit data viste også, at M

4N væsentligt reduceret indhold af aspartat i alle tre cellelinjer (Fig 4). Da aspartat fremstilles enten fra oxaloacetat ved en transamineringsreaktion eller fra fumarat gennem adenylosuccinat, M

4N-medieret cataplerosis (fig 4 og 5A) var en årsag til nedsat produktion af aspartat [33]. De metabolit data viste endvidere, at M

4N moduleret lipidmetabolismen så godt. Selvom M

4N forskelligt modulerede indholdet af forskellige typer af lipider afhængig cellelinier (S1 tabel), M

4N konsekvent reducerede indholdet af langkædede acyl-carnitin såsom palmitoylcarnitin og oleoylcarnitine (Fig 4) og forøgede indholdet af carnitin og dets derivater i alle tre cellelinier (S1 Table). Da langkædede acyl-carnitin er forudsætningen for transport langkædede fedtsyrer throughthe mitokondriemembran [34] dataene indikerede, at M

4N bør reducere β-oxidation af fedtsyrer (Fig 5B).

M

4N undertrykker energi metabolisme

Pardini

et al

. viste, at NDGA, en precursorforbindelse, hvorpå M

4N var baseret, inhiberede mitochondrial elektrontransport systemet [6-7], hvilket antyder, at M

4N kan modulere energimetabolisme (figurerne 4 og 5, og S1 Table ) gennem en effekt på mitokondrier. For at teste denne hypotese blev en luminescens-baserede enzymatisk assay udført for at måle helcelle ATP-indhold i LNCaP-celler behandlet med M

4N. Assayet (figur 6A) viste, at M

4N signifikant reduceret ATP-indhold i 5 timer. AMPK er kendt for at virke som en celle signalering sensor til ATP, ADP, og AMP og til at blive aktiveret (phosphoryleret), når forholdet mellem AMP /ATP indhold er højt [35, 36]. Forholdet mellem AMP /ATP blev forstærket af M

4N behandling siden AMP indholdet var uændret ved M

4N behandling i henhold til metabolitten assay (S1 tabel). Som forventet viste western blot-analyse, at M

4N induceret ekspression af både total AMPK og dens phosphorylerede form (T174) i 5 h (Fig 6B), hvilket indikerer, at AMPK blev aktiveret ved M

4N og M

4n-behandlede celler blev udsultet i ATP. NADH dehydrogenase (ubiquinon) Fe-S protein 1 (NDUFS1) er en underenhed af mitokondriel kompleks I. Det er blevet vist, at aktiviteten af ​​elektrontransportsystemet undertrykkes, når genet kodende for dette protein er muteret [37]. Vi fandt, at ekspressionen af ​​NDUFS1 blev undertrykt i LNCaP-celler efter 5 timer af M4N behandling (Fig 6C), hvilket indikerer, at M

4N kunne forstyrre visse komponenter af elektron transportsystem. Hyperpolarisering af ΔΨ

m anses generelt for at være en tilstand forbundet med blokering i elektron transportsystem og lav ATP generation [38]. Derfor resultatet af JC-1 farvestof eksperimenter beskrevet ovenfor (fig 2C) samt andre mitokondrier-relaterede data beskrevet her (Fig 6) understøttede den ovennævnte forudsætning, at M

4N samt NDGA havde hæmmende på mitokondrie elektron transportsystem [6, 7], undertrykke oxidativ phosphorylering og reducere cellulære ATP indhold. Alternativt faldet i ATP kunne være resultatet af en M

4N-afhængigt fald i glycolytiske flux. Fig 5A sammenfattet effekten af ​​M

4N på TCA cyklus /elektron transport systemrelaterede stofskifte. Succinatdehydrogenase som omdanner succinat til fumaratet i TCA-cyklus er også kendt som en vigtig bestanddel af komplekset II elektron transportsystem. Interessant indholdet af både succinat og fumarat blev signifikant reduceret med M

4N (figur 4), hvilket indikerer, at M

4N undertrykt metaboliske aktivitet af både TCA-cyklus og elektron transportsystem. [14].