PLoS ONE: Carnosine Hæmmer spredning af human mavekræft SGC-7901 celler gennem Begge mitokondrie Respiration og Glycolysis Pathways

Abstrakt

Carnosine, et naturligt forekommende dipeptid, er for nylig blevet påvist at have anti-tumor aktivitet. Men dens underliggende mekanisme er uklar. I denne undersøgelse undersøgte vi effekten og mekanismen af ​​carnosin på cellelevedygtigheden og proliferation af dyrkede humane mavekræft SGC-7901 celler. Carnosine behandling inducerede ikke celle apoptose eller nekrose, men reducerede den proliferative kapacitet SGC-7901 celler. Seahorse analyse viste SGC-7901 celler dyrket med pyruvat har aktiv mitokondrier, og afhænger af mitokondriel oxidativ phosphorylering mere end glycolyse pathway til produktion af ATP. Carnosin markant nedsat den absolutte værdi af mitokondrisk ATP-koblet respiration, og reducerede den maksimale iltforbrug og ekstra respiratorisk kapacitet, hvilket kan reducere mitokondriefunktionen korreleret med proliferativ potentiale. Samtidig carnosin reducerede også den ekstracellulære forsuring sats og glykolyse af SGC-7901 celler. Vores resultater antydede, at Carnosine er en potentiel regulator af energi metabolisme af SGC-7901 celler både i anaerobe og aerobe veje, og forudsat en anelse for præklinisk og klinisk evaluering af carnosin for mavekræft terapi

Henvisning:. Shen Y, Yang J, Li J, Shi X, Ouyang L, Tian Y, et al. (2014) Carnosine Hæmmer spredning af human mavekræft SGC-7901 celler gennem Begge mitokondrie Respiration og glykolyse Pathways. PLoS ONE 9 (8): e104632. doi: 10,1371 /journal.pone.0104632

Redaktør: Salvatore V. Pizzo, Duke University Medical Center, USA

Modtaget: Februar 14, 2014 Accepteret: 15 Juli 2014; Udgivet: 12. august 2014

Copyright: © 2014 Shen et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette projekt blev støttet af National Natural Science Foundation of China (81102427), og dels støttet af Zhejiang Provincial Scientific Research Foundations (Y2110322) programmet for Zhejiang førende hold af S T Innovation (2010R50048) og Wenzhou City Videnskab og Teknologi Projekt (2010S0094 ). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

mavekræft er en af ​​de mest almindelige ondartede sygdomme i verden. I de økonomisk udviklingslandene, mavekræft er den anden årsag til cancer-relaterede dødsfald [1], [2]. På trods af den forbedrede kirurgiske og multimodal terapi, den samlede 5-års overlevelse er stadig lav (15% til 35%) på grund af de høje tilbagefald satser, invasion og metastase [3]. Derfor, i det foreliggende, for at opdage mere effektive antitumorlægemidler med færre bivirkninger er brug.

-L-carnosin (β-alanyl-L-histidin) er et naturligt forekommende dipeptid, der syntetiseres af endogen carnosin syntetase. Det er vidt udbredt i pattedyrs hjerne, skeletmuskel, mave, nyrer, hjerte og hud [4], [5]. Hidtil ikke meget om sin fysiologiske funktion men flere formodede roller er blevet overvejet, såsom neurotransmitter, antiinflammatorisk middel, friradikalbindemiddel, mobil organisk pH-buffer og metalchelator [6], [7]. Det er blevet rapporteret, at carnosin er et potentielt terapeutisk middel til behandling af Alzheimers sygdom, slagtilfælde, diabetes og andre sygdomme i sanseorganerne [8], [9]. For nylig blev det påvist, at Carnosine også kan have en anti-tumorfremkaldende virkninger. For eksempel har carnosin blevet rapporteret at besidde evnen til at inhibere malign gliomer vækst [10], og denne virkning kan medieres af indflydelse på glycolytisk energimetabolisme, den bedst karakteriserede metaboliske fænotype observeret i tumorceller, kendt som Warburg virkning [11 ], [12].

for nylig har betydningen af ​​mitokondrier som ilt sensorer samt producenter af ATP blevet et omdrejningspunkt for kræftforskning, og undersøgelser har vist et vigtigt fænomen, at mitokondrier stofskifte, især citronsyre cyklus aktivitet er vigtig for den hurtige udbredelse af multiple cancer celletyper [13], [14]. Men i tilfælde af humane gastriske cancerceller, lidt information er tilgængelig i hvilket omfang glykolyse og mitokondriel oxidativ phosphorylering (OXPHOS) bidrager til den cellulære energiproduktion og hurtig proliferation. Hvorvidt carnosin kan også hæmme væksten af ​​humane gastriske cancerceller forbliver ukendt. Og om den inhiberende effekt af carnosin på vækst tumorceller også er relateret til dets virkning på mitokondrie respiration og OXPHOS fortsat uklart.

For nylig, Seahorse Bioscience XF96 Ekstracellulær Flux Analyzer er blevet brugt til samtidig og løbende overvåge både aerobe og glycolytiske komponenter af cellulære bioenergetik [15]. Derfor, i den foreliggende undersøgelse undersøgte vi virkningerne af carnosin på væksten af ​​humane gastriske cancerceller og til yderligere at karakterisere bioenergetic profil dyrkede humane gastrisk cancercellelinie SGC-7901 og de roller, carnosin i SGC-7901 celler energimetabolisme med Søhest Bioscience XF96 ekstracellulær Flux Analyzer og andre relaterede teknologier.

Materialer og metoder

Reagenser

L-Carnosin, natriumpyruvat, rotenon, carbonyl cyanid p-trifluoromethoxyphenyl-hydrazon (FCCP), antimycin, 3- [4,5-dimethylthiazol-2-yl] -2,5-diphenyltetra-zolium (MTT), methanol, mælkesyre var fra Sigma (St. Louis, MO, USA). Penicillin, streptomycin, L-glutamin, trypsin, Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM), føtalt bovint serum var fra GIBCO-BRL (Grand Island, NY, USA). Annexin V-FITC /PI apoptose afsløring kit, BCA Protein Assay Kit og ATP Assay Kit blev købt fra Beyotime Institute of Biotechnology ((Nanjing, Kina). XF assaymedium og XF kalibrant løsning blev købt fra Seahorse Bioscience.

Cell kultur

humant gastrisk cancercellelinie SGC-7901 (SGC-7901), human lever hepatocellulært carcinom cellelinje (HepG2) og rotte C6 glioma cellelinie (C6) blev erhvervet fra Shanghai Institute cellebank, Chinese Academy of Science (den oprindelige kilde er American Type Culture Collection, ATCC, Manassas, VA, USA). Celler blev dyrket i DMEM medium suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS), 100 U /ml penicillin G og 100 ug /ml streptomycin, og holdt ved 37 ° C og 5% CO

2 i en fugtig inkubator. cellerne blev trypsiniseret i et forhold på 01:03 efter sammenflydning anvendelse af 0,25% trypsin. videredyrket celler podedes på 96-, 24- eller 6-brønds plader ved densiteter på 2 × 10

3, 5 × 10

4, 2 × 10

5 eller 1 × 10

6 celler /brønd hhv.

reduktion MTT assay

Cell metaboliske aktivitet blev overvåget ved den kolorimetriske MTT-assay som tidligere [16] beskrevne. Kort fortalt blev celler dyrket på plader med 96 brønde, og der var 6 brønde i hver gruppe. I slutningen af ​​eksperimenterne blev cellerne inkuberet med 0,5 mg /ml MTT i 4 timer ved 37 ° C. Derefter blev supernatanten lag fjernet, og 100 pi dimethylsulfoxid blev tilsat til hver brønd. MTT-metabolisme blev kvantificeret spektrofotometrisk ved 570 nm i en Biorad-mikropladelæser. Resultaterne blev udtrykt som procentdelen af ​​MTT reduktion, idet absorbansen af ​​kontrolceller som 100%.

Kolonidannelse assay

Celler blev udpladet i seks-brønds plader med densitet på 100-200 celler per brønd, og derefter blev behandlet med carnosin (20 mM). Kloner blev lov at vokse i 14 dage i DMEM dyrkningsmedium suppleret med 10% FBS, 100 U /ml penicillin G og 100 ug /ml streptomycin. Celler blev efterfølgende fikseret med 70% ethanol og farvet med Coomassie Brilliant Blue til analyse af kolonidannelse som tidligere beskrevet [17].

Flowcytometrisk Assay af celledød

Celledød blev kvantificeret ved Annexin V-FITC-PI (propidiumiodid) dobbelt farvning, ved anvendelse af en Annexin V-FITC apoptosis afsløring kit ifølge producentens forslag. Kort beskrevet blev celler podet i plader med 6 brønde i DMEM-medium. Celler blev behandlet med 20 mM carnosin i 48 timer, og derefter blev opsamlet og vasket to gange i iskold PBS, resuspenderet i bindingsbuffer ved en densitet på 1 x 10

6 celler /ml. Celler blev inkuberet samtidigt med fluoresceinmærket Annexin V og PI i 20 minutter og analyseret ved flowcytometri. Annexin V-FITC genererede signaler blev detekteret med et FITC signaldetektor (FL1, 525 nm). PI signaler blev overvåget under anvendelse af en detektor, der er forbeholdt phycoerythrin emission (FL2, 575 nm). Data blev analyseret ved hjælp af Cell Quest software fra BD.

Ekstracellulær Flux Technology

For at måle forbruget ilt sats (OCR) og ekstracellulær forsuring rate (ECAR) af celler i forskellige forhold, en Seahorse XF96 ekstracellulær Flux Analyzer (Seahorse Bioscience, Billerica, MA, USA) blev anvendt. Dette instrument giver mulighed for følsomme måling af glykolyse og flere parametre om mitokondriel funktion, herunder basal OCR, reservedele respiratorisk kapacitet, maksimal OCR, ATP-koblet respiration og proton lækage fra vedhængende intakte dyrkede celler. Efter basisliniemålinger blev OCR og ECAR målt efter sekventielt at tilsætte til hver brønd 20 pi oligomycin, FCCP og rotenon, at nå arbejdsdage koncentrationer på 1 pg /ml, 1 uM og 1 uM. Alle assays blev udført ved anvendelse af en podningsdensitet på 10000 celler /brønd i 200 pi DMEM i en XF96 cellekultur mikroplade (Seahorse Bioscience). Cellerne blev skiftet til upufret DMEM suppleret med 2 mM natriumpyruvat og 20 mM carnosin 1 time før begyndelsen af ​​assayet og opretholdt ved 37 ° C. OCR er rapporteret i enheden af ​​picomol per minut og ECAR er rapporteret i milli-pH-enheder (mph) per minut.

Bestemmelse af ATP Produktion

ATP assay blev udført i overensstemmelse med producentens instruktion. Kort fortalt blev høstet dyrkede celler lyseret med en lyseringsbuffer efterfulgt af centrifugering ved 10.000 x g i 2 minutter, ved 4 ° C. Endelig i 6-brønds plader blev niveauet af ATP bestemmes ved at blande 20 pi af supernatanten med 100 pi luciferase-reagens, der katalyserede lysproduktion fra ATP og luciferin. Luminans blev målt ved en monokromator mikropladelæser. Standardkurve blev ligeledes genereret og proteinkoncentrationen for hver gruppe blev bestemt under anvendelse af BCA proteinassaykit. Totale ATP-niveauer blev udtrykt som nmol /mg protein.

HPLC-analyse af ekstracellulært mælkesyre

Koncentrationen af ​​mælkesyre i den cellefrie supernatant blev målt ved højtydende væskekromatografi (HPLC ) kombineret med en ultraviolet detektor ved anvendelse af teknikken som tidligere beskrevet. I korte træk blev de fremstillede analysates separeret på Ecosil C-18 omvendt søjle (3 um, 250 mm x 4,6 mm) under anvendelse af opløsningsmiddel A og opløsningsmiddel B [0,1 mol /l NH

4H

2PO

4 ( pH 3,4) fortyndet vol /vol i methanol 97:3] med en strømningshastighed på 0,5 ml /min. Temperaturen af ​​søjlen blev holdt ved 25 ° C, og bølgelængden af ​​UV-detektion blev indstillet til 210 nm.

Mitokondriel membranpotentiale vurdering

Ændringerne i relativ mitokondriske membranpotentiale (Δ

Ψ

m) blev vurderet ved hjælp af lipofile kationiske sonde JC-1 5,5 ‘, 6,6′-tetrachlor-1,1′, 3,3’-tetraethyl-benzamid azolocarbocyanine iodid (JC-1; Molecular Probes). Farvestoffet JC-1 undergår en reversibel ændring i fluorescensemission fra grøn til grønlig orange som Δ

y

m stiger. Celler med høj Δ

Ψ

m formular JC-1 aggregater og fluorescerer rødt; dem med lav Δ

Ψ

m indeholder monomere JC-1 og fluorescerer grønt. Efter behandling med carnosin i 48 timer blev dyrkningsmediet fjernet, og cellerne, som dyrkes på dækglas, blev inkuberet i mørke med JC-1 i en slutkoncentration på 2 uM i 20 min. Cellerne blev skyllet med PBS to gange og exciteret ved 488 nm med et Olympus BX-51 fluorescensmikroskop.

mtDNA kopital måling

Absolute mtDNA kopitallet måles ved at sammenligne PCR-amplifikation af et mitokondrier amplicon [human, NADH-ubiquinon oxidoreduktase kæde 4 (ND4)] med et nukleart amplicon (human, β-actin) fra DNA isoleret ved anvendelse af et Qiagen DNA mini kit. Primersekvenser er som følger: human β-actin (fremadrettet: 5′-ACCCACACTGTGCC CATCTAC-3 ‘; revers: 5′-TCGGTGAGGATCTTCATGAGGTA-3′); human ND4 (frem: 5’-TCCTCCTATCCCTCAACCCC-3 ‘; omvendt: 5′-CACAATCTGATGTTTT GGTTAAAC-3’). DNA-templates var lavet af regioner spænder hver amplikon ved PCR-amplifikation. Fortyndinger fra 1 × 10

8 ned til 1 × 10

2 kopier af det isolerede DNA blev anvendt til at danne en standardkurve til kvantificering. PCR cyklingsbetingelser bestod af et aktiveringstrin ved 95 ° C i 30 sek, efterfulgt af 40 cykler i 5 sek ved 95 ° C og 30 sekunder ved 58 ° C. Alle PCR’er blev udført på et Bio-Rad CFX manager Real-Time PCR System (Applied Biosciences).

Statistisk analyse

Alle data repræsenterer tre eller flere uafhængige forsøg. Data blev udtrykt som gennemsnit ± SD. Statistiske analyser blev udført af SPSS 11,5 til Windows. En-vejs ANOVA (variansanalyse) efterfulgt af LSD (mindste signifikante forskel) eller Dunnetts T3

post-hoc

test (hvor ens varianser ikke var antaget) blev anvendt til flere sammenligninger, mens t-test var bruges til sammenligninger mellem to grupper.

P

0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

Effekt af carnosin på SGC-7901 levedygtighed celler

For at bestemme virkningen af ​​carnosin på. gastrisk levedygtighed human cancer SGC-7901 celler, blev MTT reduktion anvendte assay. Resultaterne viste, at carnosin-behandlingen reducerede cellelevedygtighed på en tids- og koncentrationsafhængig måde. Carnosin i koncentrationer på 5 og 20 mM markant reduceret cellelevedygtighed til 84,0% og 57,9% af kontrol ved 24 timer, og til 73,5% og 45,9% af kontrol ved 48 h, (fig. 1A). Men carnosin i en koncentration på 1 mM ikke påvirke SGC-7901 celler levedygtighed ved 24 eller 48 t. Vi yderligere anvendes flowcytometri til at analysere, om carnosin kan forårsage SGC-7901 celle nekrose eller apoptose. Overraskende viste resultaterne, at carnosin behandling i 48 timer ikke inducerede nekrotisk eller apoptotisk celledød i SGC-7901 celler (fig. 1B). Fordi MTT reduktion også tolkes at være tegn på cellulær metabolisk aktivitet, og MTT værdien af ​​en cellepopulation bestemmes ved både antallet af levedygtige celler til stede og deres relative metaboliske hastigheder, så vi næste at beregne celleantal i et parallelt eksperiment med identisk behandlede SGC-7901 celler under anvendelse celletælling plade. Vi fandt, at celletallet i carnosin behandlet i 48 timer gruppe var den samme som i kontrolgruppen (fig. 1C), hvilket viser, at den reducerede cellelevedygtighed induceret af carnosin behandling i 48 timer i SGC-7901 celler skyldtes metaboliske ændringer men ikke på grund af celledød eller celleproliferation.

(A) Celler blev forbehandlet med forskellige koncentrationer af carnosin i 24 eller 48 timer, og derefter cellelevedygtigheden blev analyseret under anvendelse reduktionen MTT-assayet. Resultater blev udtrykt som procentdel af kontrol, og blev viste middelværdi ± SD. n = 10-12.

** P

0,01 vs. kontrol i 24 timer gruppe;

##

P

0,01 vs. kontrol i 48 h gruppe. (B) Celler blev behandlet med 20 mM carnosin i 48 timer, og derefter celledød blev bestemt ved PI og annexin V-FITC-farvning efterfulgt af flowcytometri. (C) SGC-7901-celler blev behandlet med 20 mM carnosin og det samlede celleantal blev beregnet efter carnosin behandling for 2, 3, 4, 5, 6 dage under anvendelse af celletælling plade. Data blev udtrykt som gennemsnit ± SD. n = 6.

** P

. 0,01 vs. kontrol

For at kontrollere, om disse handlinger Carnosine også findes i andre kræftceller, blev HepG2 og C6-celler anvendes. Resultaterne viste, at 20 mM carnosin behandling i 48 timer ikke inducerede celledød (tabel. S1) eller proliferation, men markant reduceret MTT reducerende aktivitet både in HepG2 og C6-celler (fig. S1).

choronic behandling med carnosin inhiberede SGC-7901 celler kolonier dannelse

for at undersøge om choronic eksponering for carnosin kan påvirke proliferative kapacitet SGC-7901 celler, blev cellerne podet ved en lav densitet (100-200 celler /brønd) og lov til at danne kolonier i 14 dage i DMEM suppleret med 20 mM carnosin. Som vist i fig. 2, choronic eksponering til Carnosine reduceret kolonier dannelse til 39,9% af kontrol.

(A) Repræsentative billeder af kloning brønde. Celler blev podet ved lav densitet i DMEM supplere med eller uden carnosin (20 mM) i 14 dage. Kolonierne blev efterfølgende fikseret med 70% ethanol og farvet med Coomassie Brilliant Blue til analyse af kolonidannelse. (B) Kvantitativ billedanalyse af kolonier i dyrkede SGC7901 celler. Data blev udtrykt som gennemsnit ± SD. n = 6.

** P

. 0,01 vs. kontrolgruppen

bioenergetic karakterisering af dyrkede SGC-7901 celler

Vi undersøgte OCRs og ECAR i dyrkede SGC-7901 celler under anvendelse af en Seahorse XF-96 ekstracellulære flux analysator, som tidligere beskrevet [18]. Basal cellulære OCR og ECAR viste sig at være 161,02 ± 29,58 pmol /min pr 10 × 10

3 celler (indledende celletal) og 39,31 ± 4.29 mph /min pr 10 × 10

3 celler (fig. 3A). ATP-koblet respiration (den samlede basal minus satsen med oligomycin, hvor oligomycin er en inhibitor af ATP-syntese) blev 96.15 ± 18,34 pmol /min per 10 × 10

3-celler, hvilket viser, at -60% af cellulær oxygen- forbruget blev relateret til ATP-syntese. Samtidig ECAR blev forøget til -250% af baseline satser i nærvær af maksimalt effektive dosis af oligomycin (1 ug /ml), hvilket indikerer, at cellerne flyttet mitokondrie respiration til glycolyse. Rotenon (1 uM) reducerede OCR til 55,78 ± 8,86 pmol /min pr 10 × 10

3-celler (~35% af baseline satser). Den rotenon-resistente afspejler den ikke-mitokondrielle respiration rate, som omfatter substratoxidering og celleoverflade iltforbrug [19]. Således kan de ikke-mitokondriel respiration udgjorde ~35%, hvorimod mitokondriel respiration udgjorde -65% af det totale cellulære respiration. Således i dyrkede SGC-7901 celler ~92% (60% /65%) af mitokondrie respiration blev koblet til ATP-syntese, og tegnede ~8% af mitokondriel respiration for ved proton lækage (fig. 3B). I nærvær af maksimalt effektive dosis af FCCP (1 uM, en afkoblingsmiddel der tillader maksimal elektrontransport,), blev en samtidig stigning i OCR observeret, og det blev øget til 204 ± 30,24 pmol /min per 10 × 10

3 celler.

(A) Real-time analyse af forbrug ilt satser (OCR) og ekstracellulære forsuring satser (ECAR) af dyrkede SGC-7901 celler ved forstyrrende dem med små molekyler metaboliske modulatorer. Oligomycin (O; 1 pg /ml), carbonyl cyanid p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP; F; 1 uM), oxamat (Ox; 100 mM), og rotenon (R; 1 uM) blev injiceret sekventielt i de angivne tidspunkter i hvert godt indeholder SGC-7901 celler efter baseline rate måling. Hver data repræsenterer middelværdi ± SD. n = 17. (B) Kvantitativ billedanalyse af OCR på dyrkede SGC-7901 celler. Basal, endogen rate; Oligomycin, ATP-syntase-inhiberet rate; FCCP, maksimal frakoblet sats; og Rotenone, rotenon-hæmmede sats. (C) Basal ECAR og proton produktionshastighed fra målinger foretaget i tandem med respiration satser. (D) ATP produktionshastighed fra oxidativ phosphorylering og glykolyse.

Vi vurderede også relative bidrag af glykolyse og OXPHOS i ATP produktionshastighed i SGC-7901 celler. Absolutte kvantificering af både den glycolytiske sats og oligomycin-følsom ilt forbrug sats blev målt i SGC-7901 celler. Den ekstracellulære forsuringshastighed skyldes primært lactat og bicarbonat produktion og, når kalibreres så protonen produktionshastighed, indikerer glycolytiske sats [15]. , Anvendes således vi oxamat at inhibere lactatdehydrogenase, som omdanner pyruvat til lactat under det sidste trin af glycolyse, at beregne proton produktionshastighed (fig. 3C). Der er en en-til-en forhold mellem lactat produktionshastighed og ATP produktionshastighed fra glykolyse. Den oligomycin-sensitive iltforbrug blev omdannet til ATP produktionshastighed under anvendelse af et P /O-forhold på 2,3 [20]. Resultaterne viste, at SGC-7901 celler dyrket i DMEM (høj glucose) suppleret med 2 mM pyruvat foretaget mindst 93% af deres ATP under anvendelse OXPHOS (fig. 3D).

Dipeptidcarnosin ændret bioenergetic karakterisering af SGC- 7901 celler

Vi undersøgte effekten af ​​carnosin på forbruget sats ilt og ekstracellulær forsuring sats i dyrkede SGC-7901 celler. Resultaterne i fig. 4 viste, at behandling med 20 mM Carnosine i 48 h reducerede basal OCR og ECAR til 141,13 ± 27,06 pmol /min pr 10 × 10

3 celler (~87% af kontrol), og 11,32 ± 2,49 mph /min pr 10 × 10

3-celler (~27% af kontrol), (fig. 4A, B). ATP-koblet respiration, proton lækage, og ikke-mitokondriel respiration rate var 81.03 ± 17,97, 7,15 ± 3,6, og 52,96 ± 8,40 pmol /min per 10 × 10

3-celler, (fig. 4C, D, E ). Således i carnosin behandlet SGC-7901 celler, mitokondriel respiration udgjorde ~62% af det totale cellulære respiration, og ~92% (57% /62%) af mitokondrie respiration blev koblet til ATP-syntese, og ~8% af mitokondriel respiration var udgjorde ved proton lækage. Derfor carnosin behandling faldt den absolutte værdi af ATP-koblet respiration, men det har ikke påvirket relative bidrag på ATP-koblet respiration, proton lækage, og ikke-mitokondrie respiration til total cellulær respiration. Derudover fandt vi også, at dipeptidcarnosin behandling markant reduceret den maksimale OCR og reservedele respiratorisk kapacitet til 161,60 ± 28,46 pmol /min pr 10 × 10

3-celler (~79% af kontrol) og 20,47 ± 6,92 pmol /min pr 10 × 10

3-celler (~47% af kontrol) (fig. 4F, G).

cellerne blev podet i specialiserede mikroplader og dyrket med eller uden carnosin (20 mM) i 48 timer. Celler blev derefter skiftet til upufret DMEM suppleret med 2 mM natriumpyruvat og 20 mM carnosin, og mitokondriefunktion blev vurderet ved anvendelse sekventiel indsprøjtning af oligomycin, FCCP, og rotenon. (A) Basal OCR, (B) Basal ECAR, (C) ATP-koblet OCR, (D) proton lækage, (E) ikke-mitokondrie OCR (Non-Mito), (F) maksimal OCR, og (G) reservedele kapacitet vises. Resultaterne er middelværdier ± SD. n = 6-9.

* P

0,05;

** P

0,01 vs. kontrolgruppen

HepG2 og C6-celler blev også anvendt til yderligere at verificere virkninger carnosine om kræft celler energi metabolisme.. Resultaterne viste, at 20 mM carnosin behandling i 48 timer markant reduceret den basale OCR og ECAR af HepG2 og C6-celler, hhv. Carnosin tilsætning reduceres også ATP-koblet respiration i C6-celler, men ikke i HepG2-celler (Fig. S2). Men 20 mM carnosin markant reduceret det cellulære ATP indhold både i HepG2 og C6-celler, hvilket indikerer, at glykolyse inhibering var involveret i carnosin handling, i det mindste i HepG2-celler (fig. S2J).

Carnosine faldt ekstracellulære mælkesyre niveau i dyrkede SGC-7901 celler

Fordi Carnosine er en mobil organisk pH-buffer, den ekstracellulære forsuring sats analyseret i den nuværende af carnosin hjælp af Seahorse XF96 ekstracellulære Flux Analyzer kan ikke afspejle den reelle glykolyse sats. Så vi også brugt HPLC til analyse af ekstracellulære mælkesyre niveau for at verificere virkningen af ​​carnosin på glykolyse i SGC-7901 celler. Vores resultater viste, at carnosin behandling markant reduceret det ekstracellulære mælkesyre niveau til 84% af kontrollen (fig. 5), hvilket indikerer, at carnosin har et potentiale inhiberende virkning på glykolyse i dyrkede SGC-7901 celler.

Cellerne blev dyrket i 48 timer i DMEM med eller uden carnosin (20 mM). Supernatanten blev opsamlet til HPLC-analyse af lactat syre. Data blev udtrykt som gennemsnit ± SD. n = 6.

** P

. 0,01 vs. kontrolgruppen

Carnosine ændrede relative bidrag af glykolyse og OXPHOS til ATP ladning i SGC-7901 celler dyrket i DMEM manglende pyruvat

Vi karakteriseret også virkningen af ​​carnosin på de ændringer i ATP-indhold og det relative bidrag af glykolyse og OXPHOS til ATP ladning i SGC-7901 celler dyrket i DMEM manglende pyruvat. Vi målte koncentration cellulære ATP i celler udsat i 45 min til seks betingelser: køretøjet, glykolyse inhibitor 2-DG, FCCP, rotenon, FCCP plus rotenon, og 2-DG plus FCCP plus rotenon. Vi fandt, at carnosin behandling i 48 timer signifikant reduceret ATP-indhold til 62% af kontrollen. 2-DG behandling markant reduceret ATP-indhold med 48% og 34% i Carnosine fraværende og Carnosine nuværende grupper i forhold til deres egne køretøjer grupper, hhv. FCCP og FCCP plus rotenon hver også væsentligt reduceret ATP-indhold med 15% og 18% i dipeptidcarnosin fraværende gruppe. Men disse medikamenter ikke påvirke ATP indhold i dipeptidcarnosin nuværende gruppe. Rotenon påvirkede ikke ATP indhold både i Carnosine fraværende eller tilstedeværende grupper. 2-DG i kombination med FCCP og rotenon væsentlige elimineret ATP produktion både i disse to grupper (fig. 6). Således 2-DG faldt ATP opkræve mere end FCCP eller rotenon gjorde både i carnosin fraværende og nuværende grupper. Disse data indikerer, at ATP generation skifter fra OXPHOS til glykolyse når mitokondriefunktionen er svækket. ATP afgift er ikke fuldt opretholdes efter hæmning af enten glykolyse eller mitokondrie funktion i carnosin fraværende gruppe, mens ATP afgift bibeholdes efter hæmning af mitokondrie funktion i dipeptidcarnosin nuværende gruppe. Således carnosin behandling ændrede relative bidrag OXPHOS og glykolyse i ATP produktionshastighed i SGC-7901 celler.

Intracellulær ATP-niveau blev målt som reaktion på glykolysen inhibitor 2-deoxyglucose (2-DG, 100 mM), mitokondrie afkobleren FCCP (1 uM), og kompleks i-inhibitor rotenon (1 uM) behandling i 45 minutter, individuelt eller i kombination som vist, i dyrkede SGC7901 celler med eller uden carnosin (20 mM) behandling i 48 timer. ATP-niveauet blev udtrykt som% af kontrol, som blev defineret som basislinieværdien i celler der kun udsættes for køretøjet. Hver data repræsenterer middelværdi ± SD. n = 6.

** P

0,01 vs. køretøj i carnosin fraværende gruppe,

## P

0,01 vs. køretøj i carnosin fraværende gruppe,

P

0,05,

P

. 0,01 vs. køretøj i Carnosine nuværende gruppe

Effekt af pyruvat på den inhiberende virkning af carnosin på SGC-7901 celler mitokondriefunktionen

for at undersøge om at øge niveauet for pyruvat kan vende inhiberende effekt af carnosin på mitokondrie respiration af SGC-7901 celler, blev cellerne udsat for forskellige koncentrationer af pyruvat. Som vist i tabel. 1, øge niveauet af pyruvat kunne ikke vende den inhiberende effekt af carnosin på SGC-7901 celler mitokondrie åndedræt. Desuden MTT-assayet viste også, at øge niveauet for pyruvat ikke kunne vende den carnosin virkning på SGC-7901 celler mitokondrie metabolisme (fig. 7). Salg

(a) ændringer i JC-1 fluorescens med carnosin behandling i dyrkede SGC-7901 celler. Cellerne blev behandlet med carnosin (20 mM) i 48 timer, og derefter blev farvet med JC-1. Rød fluorescens indikerer en polariseret tilstand og grøn fluorescens indikerer en depolariseret tilstand. Scale bar: 20 pm. (B) mtDNA kopi nummer i SGC-7901 celler behandlet med eller uden dipeptidcarnosin.

Effekter af carnosin på mitokondrie-DNA indhold og mitrokondriemembranen i SGC-7901 celler

mitokondrie membran potentiale (Δ

Ψ

m) tegner sig for størstedelen af ​​proton-drivende kraft, der anvendes til at drive ATP syntese og har derfor en betydelig rolle i den maksimale ATP-produktionskapacitet [21]. Derfor brugte vi også den lipofile kationiske sonde JC-1 at undersøge, om Carnosine undertrykker OXPHOS via undertrykkelse af mitochondriemembranpotential (Δ

Ψ

m). Resultaterne viste, at carnosin behandling i 48 timer ikke kunne fremkalde en tydelig ændring af Δ

Ψ

m i dyrkede SGC-7901 celler (Fig. 8A). Salg

SGC-7901 celler blev dyrket i DMEM suppleret med stigende doser af pyruvat (2, 4, 6 mM) i nærvær eller fravær af carnosin (20 mM) i 48 timer, og derefter blev cellerne mitokondrie metabolisme aktivitet blev målt ved MTT reduktion assay. Resultaterne er gennemsnit ± SD. n = 8-16.

** P

. 0,01 vs. kontrolgruppen

For at løse tilsyneladende faldet mitokondrielle respiration fremkaldt af carnosin, vi kvantificeret også den absolutte mitokondrie-DNA (mtDNA) nummer, som reguleres stramt for at opretholde cellulære energibehov [22]. Til vores overraskelse, resultaterne viste, at sammenlignet med kontrol- celler, de absolutte mtDNA kopiere antal Carnosine-behandlet 7901 celler blev markant forøget, og den gennemsnitlige absolutte mtDNA kopiere numre var 141,49 ± 7,42 i kontrol celler og 360,0 ± 59,84 i Carnosine -behandlede celler (fig. 8B).

diskussion

Så vidt vi ved, er dette den første rapport fra bioenergetic profil af dyrkede SGC-7901 celler behandlet med og uden carnosin. Vores vigtigste resultater er som følger. Første, carnosin reduceret proliferative kapacitet SGC-7901 celler. For det andet har celler dyrket i DMEM (høj glucose) suppleret med 2 mM pyruvat lavet ~93% af deres ATP under anvendelse OXPHOS. Tredje, carnosin udøvede sin hæmmende virkning på SGC-7901 celler proliferation gennem inhibering glycolyse, OXPHOS og mitokondriel respiration af cellerne, og disse handlinger carnosin blev også fundet i HepG2 og C6-celler. Således bør carnosin overvejes sammen med den voksende bevæbning af forbindelser i forskellige udviklingsstadier lægemiddel, der er målrettet tumor metabolisme, en af ​​de vigtigste kendetegn ved tumor [23].

grund af sin bredt aktivitetsspektrum, carnosin kan considerded som et terapeutisk faktor i behandlingen af ​​mange sygdomme. For eksempel har Zinc Carnosine blevet anvendt til gastrisk sundhed og for gut reparation [24]. For nylig undersøgelser viste transformerede celler voksede ikke i MEM indeholdende høje koncentrationer af carnosin, og carnosin kunne indgives som et lægemiddel in vivo til at inhibere væksten af ​​maligne celler [25]. det havde imidlertid at blive spurgt, om Carnosine kan forhindre væksten af ​​humane gastriske tumorceller udover de maligne celler, der tidligere er blevet rapporteret.